Streptavidin Sigma CAS 9013-20-1

1. Kun af streptavidin
Streptavidin (SA), proteina mnixxija derivata minn Streptomyces avidinii, għandha piż molekulari ta' madwar 65-66 kDa u punt iżoelettriku ta' madwar 6.0. Hija proteina tetramer magħmula minn erba 'subunitajiet omoloġi, kull waħda b'sit indipendenti ta' rbit tal-bijotina - li jfisser li molekula waħda ta 'streptavidin tista' simultanjament torbot ma 'erba' molekuli ta 'bijotina. Il-kostanti tad-dissoċjazzjoni (Kd) bejn it-tnejn hija baxxa daqs madwar 10 ⁻¹⁵ M, li hija waħda mill-interazzjonijiet bijoloġiċi mhux kovalenti magħrufa l-aktar b'saħħithom u tista 'titqies bħala l-iktar "mekkaniżmu ta' qfil molekulari" fin-natura.

Meta mqabbel ma 'avidin derivat mill-abjad tal-bajd, għandu vantaġġi mingħajr paragun:

Ma fihx modifiki ta' glycosylation, huwa b'mod ġenerali newtrali elettrikament, għalhekk għandu rbit mhux-speċifiku estremament baxx taħt kundizzjonijiet fiżjoloġiċi, sfond sperimentali nadif, u proporzjon eċċellenti ta' sinjal-għa-storbju. Barra minn hekk, ir-reżistenza eċċellenti tagħha għad-denaturazzjoni u d-degradazzjoni tal-protease, kif ukoll il-kapaċità tagħha li tiflaħ pH estremi, temperaturi għoljin (70-80 grad C), solventi organiċi, u aġenti denaturanti konvenzjonali (bħal SDS u urea), ħadu post l-avidin u saru l-"standard tad-deheb" mhux ikkontestat fis-sistemi ta 'rbit tal-bijotina.

Huwa preċiżament b'dawn il-karatteristiċi pendenti li jiddi f'oqsma bħax-xjenzi tal-ħajja, dijanjostiċi in vitro, screening tad-droga, u biosensing.

2. Ittestjar immuni
L-applikazzjoni fil-qasam tas-sejbien immuni hija l-aktar applikazzjoni klassika u użata ħafna. Mill-iżvilupp tagħha fl-aħħar tas-snin sebgħin, is-sistema tal-bijotina streptavidin (BAS) saret il-pedament tal-ittikkettjar immuni u l-analiżi tat-traċċar minħabba l-affinità ultra-għolja u l-effett ta 'amplifikazzjoni tal-kaskata. Skont l-istatistika, madwar 85% tal-analizzaturi tal-kimiluminixxenza komuni jużaw metodi ta 'skoperta bbażati fuq BAS, li jindikaw il-pożizzjoni dominanti tagħhom.

2.1 Assaġġ immunosorbenti marbut ma' enzimi (ELISA)

Fl-ELISA, horseradish peroxidase (HRP) jew alkaline phosphatase (AP) jistgħu jiġu akkoppjati u l-enzima tista 'tiġi gwidata b'mod preċiż lejn il-mira permezz ta' antikorpi bijotinilati. HRP jikkatalizza sottostrati luminixxenti TMB, DAB, jew ECL biex jipproduċi sinjali kimiċi jew ottiċi qawwija, filwaqt li AP jikkatalizza BCIP/NBT, PNPP u substrati oħra biex jipproduċi sinjali ta 'kulur jew kimiluminixxenza stabbli. Molekula fil-mira bijotinilata tista' tingħaqad ma' streptavidin tikkettat multiplu, li tikseb amplifikazzjoni tas-sinjali f'diversi-livelli u tagħmel possibbli l-iskoperta ta' miri ta' abbundanza baxxa. Din it-teknoloġija tintuża ħafna f'ELISA sandwich u kompetittiva, li tkopri xenarji bħall-kwantifikazzjoni tal-proteini, skoperta ta 'antikorpi, screening ta' patoġeni, eċċ.

2.2 Immunoblotting tal-proteini (Western Blot)
Fil-Western Blot, l-irbit ma 'antikorpi sekondarji bijotinilati jista' jtejjeb b'mod sinifikanti l-intensità tas-sinjal tal-proteini fil-mira fuq films ta 'trasferiment. Meta mqabbla ma 'sistemi tradizzjonali ta' antikorpi sekondarji, is-sistemi BAS jistgħu jiksbu amplifikazzjoni tas-sinjali aktar b'saħħitha minħabba l-proprjetajiet ta 'rbit tetravalenti tagħhom. Barra minn hekk, minħabba t-twaħħil mhux speċifiku baxx ta' streptavidin, l-interferenza fl-isfond titnaqqas b'mod sinifikanti, u tagħmilhom partikolarment adattati għall-analiżi kwantitattiva ta' proteini ta' abbundanza baxxa.

2.3 Immunoistokimika (IHC) u Immunoċitokimika (ICC)
Streptavidin tikkettat HRP jew tikketta AP huwa l-għodda preferuta ta 'amplifikazzjoni tas-sinjal għal IHC u ICC. Is-sistema HRP hija adattata għal esperimenti li jeħtieġu sensittività ta 'skoperta estremament għolja, filwaqt li s-sistema AP hija partikolarment adattata għal sistemi li fihom inibituri HRP (bħal sodium azide) jew xenarji sperimentali li jeħtieġu żvilupp tal-kulur u stabbiltà tas-sinjali fit-tul-. Billi torbot sondi jew antikorpi bijotinilati ma 'konjugati ta' streptavidin, molekuli fil-mira jistgħu jinstabu b'mod preċiż f'sezzjonijiet tat-tessuti jew kampjuni taċ-ċelluli.

2.4 Immunofluworexxenza (IF) u ibridizzazzjoni in situ (ISH)

Streptavidin ittikkettat bil-fluworexxeina (bħal FITC Streptavidin, PE Streptavidin, APC Streptavidin) hija għodda ta 'viżwalizzazzjoni universali għal tbajja ta' immunofluworexxenza u ibridizzazzjoni in situ. Il-markatur FITC għandu wavelength ta 'eċċitazzjoni/emissjoni ta' madwar 494/519 nm u juri fluworexxenza aħdar jgħajjat; Il-wavelength ta 'eċċitazzjoni/emissjoni tal-markatur PE huwa ta' madwar 565/578 nm, li huwa l-"istandard tad-deheb" għall-analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss b'ħafna -kulur; Il-markatur APC ikopri l-ispettru aħmar imbiegħed, u jiffaċilita immaġini b'ħafna-kuluri. Dawn il-markaturi fluworexxenti jistgħu jorbtu b'mod preċiż ma 'antikorpi bijotinilati jew sondi ta' aċidu nuklejku biex jiksbu analiżi ta 'lokalizzazzjoni u skoperta kwantitattiva ta' molekuli fil-mira.

2.5 Ċitometrija tal-fluss (FACS)

Fiċ-ċitometrija tal-fluss, streptavidin immarkat b'mod fluworexxenti (speċjalment tikkettat PE) jintuża biex jiskopri antiġeni tal-wiċċ taċ-ċelluli ttikkettjati b'antikorpi bijotinilati. Il-luminożità eċċellenti tagħha tipprovdi proporzjon ta' sinjal-għall--storbju estremament għoli, li jista' jikxef b'mod effettiv popolazzjonijiet ta' ċelluli b'espressjoni baxxa ta' antiġen tal-wiċċ jew sinjali dgħajfa. Huwa reaġent indispensabbli fl-analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss b'ħafna -kulur.

2.6 Assaġġ Immunospot marbut ma' enzimi (ELISPOT)
Streptavidin bit-tikketta AP juri prestazzjoni eċċellenti f'ELISPOT u huwa adattat għal analiżi ta'-fażi solida u sistemi ta' tbajja' ta' tessuti/ċelluli. Jista' jikkatalizza b'mod stabbli l-produzzjoni tas-sottostrat ta' sinjali tal-post li jistgħu jingħaddu għall-kxif ta' sekrezzjoni ta' ċitokini fil-livell ta'-ċellula waħda.

3. Purifikazzjoni ta 'proteini u aċidi nuklejċi
3.1 Kromatografija ta' affinità u purifikazzjoni tal-proteini
Streptomycin huwa l-komponent ewlieni tal-ippakkjar tal-kromatografija tal-affinità. Wara li l-bijotina tittikkettja l-proteina li trid tiġi ppurifikata, titħallat ma 'ġell ta' streptavidin agarose (bħal Streptavidin Agarose/Sepharose), u l-proteina ttikkettjata torbot mill-qrib ma 'streptavidin fuq il-mili. Billi taħsel biex tneħħi l-impuritajiet, u mbagħad taħsel il-proteina fil-mira taħt kundizzjonijiet xierqa (bħal SDS-PAĠNA buffer jagħli, trattament SDS 0.1%, jew trattament 95% formamide+10 mM EDTA f'pH 8.2), jistgħu jinkisbu prodotti ta 'purità għolja-.

Meta tieħu l-produzzjoni industrijali ta 'insulina umana rikombinanti bħala eżempju, żibeġ manjetiċi ta' streptavidin ta '{0}}kwalità għolja jistgħu jorbtu aktar minn 1200 pmol ta' bijotina ħielsa għal kull milligramma, u l-purità tal-proteina purifikata tista 'tilħaq aktar minn 95%.

3.2 Immunopreċipitazzjoni (IP) u immunopreċipitazzjoni tal-kromatin (ChIP)
L-applikazzjoni ta 'żibeġ manjetiċi ta' streptavidin fl-immunopreċipitazzjoni ttejjeb ħafna l-effiċjenza sperimentali. Ir-riċerkaturi jistgħu jiffissaw antikorpi bijotinilati fuq żibeġ manjetiċi ta 'streptavidin u jinkubawhom b'lisat taċ-ċelluli.

L-antikorpi jaqbdu speċifikament il-proteina fil-mira u l-proteini li jinteraġixxu tagħha, u jiffurmaw kumpless ta '"proteina fil-mira ta' antikorp żibeġ manjetiku". Jista 'jiġi separat malajr taħt l-azzjoni ta' kamp manjetiku estern, b'tħaddim sempliċi u sensittività għolja. Fl-esperimenti ChIP, żibeġ manjetiċi ta 'streptavidin intużaw ukoll biex jaqbdu kumplessi ta' proteini tad-DNA bijotinilati u jistudjaw l-interazzjoni bejn il-proteini u d-DNA.

3.3 Iġbed l-esperiment
Fl-istudju tal-proteini-interazzjonijiet tal-proteini, żibeġ manjetiċi jistgħu jaqbdu proteini tal-lixka bijotinilati u mbagħad "ħut" għal pre-proteini li jinteraġixxu magħhom. Pereżempju, meta jiġu studjati mogħdijiet ta 'sinjalazzjoni ewlenin fiċ-ċelluli tat-tumur, antikorpi speċifiċi li jirrikonoxxu l-proteina P53 huma immobilizzati fuq żibeġ manjetiċi ta' streptavidin u ko inkubati ma 'lisat taċ-ċelluli tat-tumur biex jarrikkixxu b'mod effettiv P53 u l-proteini assoċjati tiegħu. Meta mqabbel ma 'metodi tradizzjonali ta' immunopreċipitazzjoni, xoffa manjetika IP għandha sensittività u speċifiċità ogħla, u tista 'ttejjeb b'mod aktar effettiv il-proteini fil-mira ta' abbundanza baxxa.

3.4 RNA Iġbed-l isfel
Żibeġ manjetiċi huma adattati wkoll għal esperimenti ta' pull-l ​​isfel tal-RNA. Wara li jingħaqdu ma 'żibeġ manjetiċi ta' streptavidin, sondi RNA bijotinilati jistgħu jaqbdu proteini li jinteraġixxu ma 'l-RNA minn lisati taċ-ċelluli għall-istudju tan-netwerks ta' interazzjoni tal-proteini RNA.
3.5 Preparazzjoni tad-DNA single stranded u estrazzjoni ta' aċidu nuklejku
Jista 'jorbot ma' oligonukleotidi bijotinilati għall-preparazzjoni ta 'DNA single stranded u estrazzjoni effiċjenti ta' aċidi nuklejċi, li għandhom rwol importanti fil-klonazzjoni molekulari u l-inġinerija ġenetika.

4. Sejbien ta ' throughput għoli u screening tad-droga
4.1. Pjattaforma tal-ittestjar TR-FRET
Jista' jiġi akkoppjat ma' kelati luminixxenti bħal kelati tal-europju biex iwettaq konnessjoni tas-sinjali u qbid molekulari fis-sistema ta' sejbien TR-FRET (trasferiment tal-enerġija tar-reżonanza tal-fluworexxenza riżolta fil-ħin). Per eżempju, THUNDER ™ L-istreptavidin ittikkettat ta 'europju ddisinjat speċifikament għall-pjattaforma sperimentali TR-FRET jista' jorbot b'mod stabbli ma 'diversi molekuli modifikati bijotinilati u huwa użat ħafna fl-analiżi tal-interazzjoni tal-proteini u l-iskrinjar preliminari ta' mediċini fil-mira.

Din is-sistema hija omoġenja u{0}}għoli, li tagħmilha għodda qawwija għall-iżvilupp modern tad-droga.

4.2 Twassil immirat tad-droga
Il-proprjetajiet li jorbtu l-bijotina tiegħu jagħmluha trasportatur ideali għal sistemi ta 'kunsinna mmirati tad-droga. Billi tgħaqqad il-molekuli tad-droga mal-bijotina u tuża l-abbiltà ta 'irbit immirat ta' streptavidin, tista 'tinkiseb kunsinna preċiża tal-mediċina, ittejjeb l-effiċjenza tat-trattament u tnaqqas l-effetti sekondarji.

4.3 Biosensors u Biochips

Huwa l-materjal ewlieni għall-produzzjoni ta 'biosensors u biochips. Billi jimmobilizza streptavidin fuq il-wiċċ taċ-ċippa bħala element ta 'qbid, sondi jew antikorpi ta' proteini ttikkettjati bi bijotina jistgħu jiġu immobilizzati fuqha, u jiksbu skoperta ta'-throughput għoli u-sensittività għolja. Pereżempju, fl-iskrinjar bikri taċ-ċipep tal-proteini għal mard kardjovaskulari, żibeġ manjetiċi ta 'streptavidin huma mwaħħla fuq is-sottostrat taċ-ċippa u użati biex jgħaqqdu sondi tal-proteini bijotinilati. Dan jista 'jsib b'mod preċiż anormalitajiet f'pazjenti fl-istadji bikrija tal-marda u meta l-konċentrazzjonijiet tal-markaturi tad-demm huma baxxi daqs cTnI ta' 0.01 ng/mL, tavvanza t-tieqa dijanjostika b'2-3 sigħat meta mqabbla mal-metodi dijanjostiċi tradizzjonali.

5. Bijoloġija taċ-ċelluli u Immaġini
5.1 Tikkettar tal-wiċċ taċ-ċelluli u għażla taċ-ċelluli fluworexxenti
Streptavidin ittikkettat fluworexxenti (bħal Vari Fluor 488 Streptavidin) huwa użat ħafna għat-tikkettar tal-wiċċ taċ-ċelluli u l-għażla taċ-ċelluli fluworexxenti. L-ispettru ta 'emissjoni tiegħu jkopri l-ispettru kollu tad-dawl viżibbli u qrib-infra-aħmar, u f'esperimenti ta' tikkettjar b'ħafna-kuluri, jista 'faċilment jidħol fin-nukleu u l-istruttura ċitoplasmika, ittikketta proteini fil-mira għall-immaġini u l-analiżi.

5.2 Nanoteknoloġija u Materjal Self Assembly
Il-proprjetajiet ta' rbit tetravalenti tiegħu jagħmluha "pont" ideali għall-awto-assemblaġġ ta' nanomaterjali. Permezz tal-irbit immirat tal-bijotin streptavidin, jistgħu jinbnew diversi nanostrutturi għal riċerka interdixxiplinarja bħal immaġini bijoloġiċi u monitoraġġ ambjentali.

6. Antikorp kontra streptavidin
Bl-użu mifrux tas-sistema tal-bijotina streptavidin, ħarġet kwistjoni ta' spiss injorata - antikorpi endoġeni kontra streptavidin (ASA) fil-kampjun jistgħu jinterferixxu mas-sistema ta' skoperta. Ir-riċerka sabet li t-twaħħil ta 'ASA ma' SA fis-sistema ta 'reazzjoni jista' jaffettwa l-kostruzzjoni korretta ta 'sistemi speċifiċi ta' antikorpi antiġeni, li jirriżulta fi preċiżjoni kompromessa ta 'akkoppjar, skoperta jew riżultati dijanjostiċi.

Biex tiġi indirizzata din l-isfida, ħarġu kits ta 'skoperta ta' antikorpi kontra streptavidin, li jistgħu jintużaw biex jiskopru ASA endoġenu f'kampjuni ta 'pazjenti u jevitaw l-interferenza tiegħu mas-sistema BAS. Roche Custom Biotech żviluppat mutant streptavidin inattiv (Streptavidin rec. inactive, poly), li jista 'jiġi miżjud mas-sistema attwali mingħajr passi addizzjonali biex jimblokka u jelimina speċifikament l-interferenza ASA, ittejjeb l-eżattezza u l-ispeċifiċità tas-sistema ta' skoperta.

7. Interferenza tal-bijotina
Għalkemm is-sistema tal-bijotina streptavidin hija qawwija, tiffaċċja sfida dejjem aktar severa - interferenza tal-bijotina.

Meta jkun hemm konċentrazzjoni għolja ta 'bijotina ħielsa fil-kampjun tat-test, jikkompeti ma' antikorpi bijotinilati għas-sit ta 'rbit ta' streptavidin, li jirriżulta f'riżultati ta 'skoperta mgħawġa.

L-amministrazzjoni orali ta '100 mg bijotina tista' twassal għal konċentrazzjoni massima fil-plażma ta '375-450 ng/mL; Pazjenti bi sklerożi multipla jistgħu jieħdu 300 mg/d mill-ħalq, u l-livelli tal-bijotina fil-plażma tagħhom jistgħu jaqbżu l-1000 ng/mL; It-teħid ta 'kuljum ta' 500 mg ta 'bijotina jista' jwassal għal konċentrazzjonijiet estremament għoljin ta 'bijotina fid-demm. Fl-immunoassays sandwich, bijotina eċċessiva tista 'tipproduċi riżultati baxxi żbaljati; F'immunoassays kompetittivi, jista 'jwassal għal riżultati għoljin żbaljati.

Bosta studji wrew li, TSH, Thyroxine PTH, testijiet endokrinali bħal ormon adrenokortikotropiku, prolactin, testosterone, cortisol, kif ukoll markaturi tat-tumur u markaturi funzjonali tal-qalb, huma kollha affettwati fi gradi differenti minn interferenza tal-bijotina. L-FDA suċċessivament ħarġet informazzjoni ta 'twissija u linji gwida korrispondenti. L-istrateġiji ta' tlaħħaq jinkludu: dilwizzjoni serjali ta' kampjuni, bidla għal metodi mhux BAS bħall-kromatografija likwida-spettrometrija tal-massa, ittestjar mill-ġdid wara t-tneħħija tal-bijotina (sagħtejn qasira, sakemm 15-il jum jew saħansitra xahar), jew l-użu ta' kenniesa tal-bijotina ħielsa.